Respiratorisches Panel Biofire inkl. SARS-CoV-2

Respirat. Panel inkl. SARS-CoV-2

Allgemeines

Viele virale und bakterielle Atemwegserreger können sehr ähnliche klinische Bilder hervorrufen.
Das Respiratorische Panel ist ein qualitativer In-vitro-Multiplex-Diagnosetest auf Nukleinsäurebasis mit SEHR kurzer Analysenzeit von 1 Stunde
Es ermöglicht den Nachweis und gleichzeitig die Bestimmung mehrerer bakterieller und viraler Nukleinsäuren direkt aus dem Abstrich von Personen mit Anzeichen und/oder Symptomen von Bronchitis oder Pneumonie/oberer oder unterer Atemwegsinfektion.
Die folgenden 23 Organismen werden bei Anwendung des FilmArray ME Panel bestimmt:
- Viren:
  - Adenovirus
  - SARS-CoV-2
  - Middle East Respiratory Syncial CoronaVirus (Mers-CoV)
  - Coronavirus 229E
  - Coronavirus HKU1
  - Coronavirus OC43
  - Coronavirus NL63
  - Humaner Metapneumovirus
  - Humaner Rhinovirus/Enterovirus
  - Influenza A
  - Influenza A/H1
  - Influenza A/H1-2009
  - Influenza A/H3
  - Influenza B
  - Parainfluenza 1
  - Parainfluenza 2
  - Parainfluenza 3
  - Parainfluenza 4
  - RSV
- Bakterien:
  - Bordetella pertussis
  - Bordetella parapertussis
  - Chlamydophila pneumoniae
  - Mycoplasma pneumoniae

Indikation

Verdacht auf Pneumonie
- Fieber
- Husten
- Auswurf
- Tachypnoe/erhöhte Atemfrequenz
- Sauerstoff-Sättigungsverminderung
- Infiltrate im Röntgen
Verdacht auf Bronchitis
- Husten
- Auswurf
Therapierefraktärität gegenüber üblicher Therapie
Unklarere epidemiologische Situationen
Fulminante Verläufe
Beatmungspflichtigkeit

Material

Probenmaterial:

Sputum, Abstrich, BAL oder Trachealsekret

Probenentnahme:

Die Probe sollte gemäß einem Standardverfahren genommen und in das Applikator-Röhrchen überführt werden.

Transport und Lagerung:

Proben sollten so schnell wie möglich verarbeitet und getestet werden.
Wenn eine Lagerung erforderlich ist, können die Proben bis zu einem Tag bei Raumtemperatur (ungefähr 23 °C) oder bei Kühlschranktemperatur (ungefähr 4 °C) bis zu sieben Tagen aufbewahrt werden

Stabilität
Raumtemperatur	4 Stunden
2 – 8°C	3 Tage
kälter als minus 15°C	30 Tage

Ansatz- / Messzeiten

täglich

Referenzbereich

Abstrich:

nicht nachgewiesen

Beurteilung der Ergebnisse

Wenn die PCR der 2. Stufe abgeschlossen ist, führt das FilmArray-Gerät/-Module eine hochauflösende DNA-Schmelzanalyse der PCR-Produkte durch und misst das Fluoreszenzsignal, das in den einzelnen Vertiefungen erzeugt wird. Die FilmArray Software führt dann mehrere Analysen durch und gibt am Ende ein Assay-Ergebnis aus.

Analyse von Schmelzkurven:

Die FilmArray Software evaluiert die DNS-Schmelzkurve für jede Vertiefung des PCR-Array der 2. Stufe, um zu bestimmen, ob ein PCR-Produkt in der Vertiefung vorhanden war.
Wenn das Schmelzprofil das Vorhandensein eines PCR-Produkts anzeigt, berechnet die Analyse-Software die Schmelztemperatur (Tm) der Kurve.
Der Tm-Wert wird dann mit dem erwarteten Tm-Bereich für den Assay verglichen. Wenn die Software bestimmt, dass der Schmelzpunkt positiv ist, und der Schmelz-Peak in den Assay-spezifischen Tm-Bereich fällt, wird die Kurve als positiv bezeichnet.
Wenn die Software bestimmt, dass die Schmelze negativ ist oder nicht im richtigen Tm-Bereich liegt, wird die Kurve als negativ bezeichnet.

Analyse von Replikaten:

Sobald Schmelzkurven bestimmt worden sind, evaluiert die Software die drei Replikate für jeden Assay, um das Assay-Ergebnis zu bestimmen.
Damit ein Assay als positiv gelten kann, müssen mindestens zwei von den drei zusammengehörigen Schmelzkurven positiv sein und die Tm der drei positiven Kurven müssen ähnlich sein (innerhalb von 1°C).
Assays, die dieses Kriterium nicht erfüllen, gelten als negativ.

Interpretation von Organismen:

Für die meisten Organismen, die vom FilmArray RP nachgewiesen werden, gilt der Organismus als Detected (Nachgewiesen), wenn ein einziger entsprechender Assay positiv ist.
Beispielsweise erhält Humanes Metapneumovirus den Befund Human Metapneumovirus Detected (Humanes Metapneumovirus nachgewiesen), wenn mindestens zwei von drei Replikaten des einen Humanen Metapneumovirus Assays zwei ähnliche positive Schmelz-Peaks mit Tm-Werten aufweisen, die innerhalb des Assay-spezifischen Tm-Bereichs liegen.
Die Befunde für Adenovirus, die Humane Rhinovirus/Enterovirus-Gruppe und Influenza A hängen von der Interpretation von Ergebnissen mehrerer Assays ab. Die Interpretation und Folgetests für diese drei Ergebnisse sind nachstehend angegeben.

Rhinovirus/Enterovirus-Gruppe:

Der FilmArray RP-Riegel enthält sechs unterschiedliche Assays (HRV1, HRV2, HRV3, HRV4, Entero 1, Entero 2) für den Nachweis von Rhinoviren und Enteroviren. Obwohl diese Viren beide sehr divers sind, sind sie doch nahe verwandt. Daher können die sechs Assays zwischen Rhinovirus und Enterovirus nicht zuverlässig unterscheiden.
Die FilmArray Software interpretiert jeden der sechs Assays unabhängig (wie oben beschrieben), und die Ergebnisse werden in dem Endbefund für das Virus / die Viren kombiniert.
- Wenn einer der sechs Assays positiv ist, lautet der Befund Human Rhinovirus/Enterovirus Detected (Humanes Rhinovirus/Enterovirus nachgewiesen).
- Wenn alle sechs Assays positiv sind, lautet der Befund Human Rhinovirus/Enterovirus Not Detected (Humanes Rhinovirus/Enterovirus nicht nachgewiesen).
- An ein positives Testergebnis des FilmArray RP in Bezug auf Rhinovirus/Enterovirus sollte sich ein alternatives Verfahren (z.B. Zellkultur oder Sequenzanalyse) anschließen.
- HINWEIS: Trotz ihrer Bezeichnungen sind die HRV (1-4) und Entero (1-2) Assays nicht spezifisch für den Nachweis von Humanem Rhinovirus bzw. Enterovirus. Einzelne Assay-Ergebnisse können nicht verwendet werden, um zwischen diesen beiden Viren zu unterscheiden.

Adenovirus:

Der FilmArray RP-Riegel enthält zwei verschiedene Assays (Adeno, Adeno2) für den Nachweis von Adenovirus.
Die FilmArray Software interpretiert jeden dieser Assays unabhängig (wie oben beschrieben), und die Ergebnisse werden in dem Endbefund für das Virus kombiniert.
Wenn einer oder beide Assays positiv sind, lautet der Befund Adenovirus Detected (Adenovirus nachgewiesen).
Wenn sowohl der Adeno als auch der Adeno2 Assay negativ ist, lautet der Befund Adenovirus Not Detected (Adenovirus nicht nachgewiesen).

Influenza A:

Die Assays im FilmArray RP sind dafür ausgelegt, sowohl Influenza A nachzuweisen als auch zwischen üblicherweise vorkommenden Hämagglutinin-Subtypen zu unterscheiden.
Zu diesem Zweck verwendet der FilmArray RP zwei Influenza A Assays, (FluA-pan-1 und FluA-pan-2) und drei Subtypisierungs-Assays, die auf das Hämagglutinin-Gen gerichtet sind (FluA-H1-pan, FluA-H12009 und FluA-H3).
Der FluA-H1-pan Assay ist dafür ausgelegt, sowohl die Variante Influenza A H1 als auch die Variante Influenza A H1-2009 nachzuweisen.
Jeder der individuellen Assays wird unabhängig interpretiert (wie oben beschrieben), und der für Influenza A vergebene Befund basiert auf den kombinierten Ergebnissen der fünf Assays, wie in Tabelle 3 dargestellt.
Im Allgemeinen wird Influenza A Detected (Nachgewiesen) bestimmt, wenn mindestens einer der beiden FluA-pan Assays positiv ist und ein Subtypisierungs-Assay ebenfalls positiv ist.
Wenn keiner der FluA-pan Assays positiv ist, aber ein Subtypisierungs-Assay positiv ist, dann wird der Befund für diesen spezifischen Subtyp als Equivocal (Mehrdeutig) betrachtet, und die Probe sollte erneut getestet werden.
Wenn einer der FluA-pan Assays positiv ist und keiner der Subtypisierungs-Assays positiv ist, ist das Ergebnis für Influenza A Equivocal (Mehrdeutig), und die Probe sollte erneut getestet werden.
Alle Equivocal (Mehrdeutigen) Ergebnisse sollten erneut getestet werden.

Grenzen des Verfahrens

Da während der prospektiven klinischen Studie für bestimmte Organismen nur eine kleine Zahl von positiven Proben erhalten wurde, wurden die Leistungsdaten für Bordetella pertussis, Coronavirus 229E, Coronavirus OC43, Influenza A H1, Influenza A H3, Influenza A H1-2009, Influenza B, Mycoplasma pneumoniae, Parainfluenzavirus 1, Parainfluenzavirus 2 und Parainfluenzavirus 4 vorwiegend mit retrospektiven klinischen Proben erstellt. Die Leistungsdaten für Chlamydophila pneumoniae wurden vorwiegend unter Verwendung von speziell vorbereiten klinischen Proben erstellt. Die Leistungsfähigkeit dieses Tests wurde für die Beobachtung der Behandlung von saisonalen Infektionen mit Influenza A H1, A H3, A H1-2009 oder RSV nicht festgestellt.

Adenovirus:

Der Filmarray RP Adenovirus Assay kann einen variablen Nachweis mit nicht-respiratorischen Serotypen innerhalb der Spezies A, D, F und G zeigen.

Influenza:

Die FilmArray RP Influenza A Subtypisierungs-Assays sind nur auf das Hämagglutinin-Gen von Influenza A gerichtet. Das Neuraminidase-Gen von Influenza wird vom FilmArray RP weder nachgewiesen noch unterschieden.
Die klinische Spezifität wurde festgestellt, als Influenza A H1-2009 das dominante umlaufende Influenza A Virus war. Mit dem Auftauchen anderer Influenza A Viren kann die klinische Spezifität variieren.
Die Leistungsfähigkeit des Film Array RP wurden nicht für Personen festgestellt, die eine Influenzaimpfung erhalten haben. Eine kürzlich verabreichte nasale Influenzaimpfung kann zu falsch positiven Ergebnissen für Influenza A und/oder Influenza B führen.
Der FilmArray RP ist möglicherweise nicht in der Lage, zwischen bereits vorhandenen viralen Stämmen und neuen Varianten zu unterscheiden, die sich noch entwickeln. Beispielsweise kann der FilmArray RP Influenza A H3N2v nachweisen (erstmals im August 2011 nachgewiesen), ist aber nicht in der Lage, diese Variante von der saisonalen Influenza A H3N2 zu unterscheiden.

Coronaviren:

Der Coronavirus OC43 Assay kann zu Kreuzreaktionen mit Coronavirus HKU1 führen. Wenn sowohl HKU1 als auch OC43 in der Probe desselben Patienten nachgewiesen werden, kann das Ergebnis auf eine Kreuzreaktivität des Assay zurückgehen. Eine gleichzeitige Infektion mit diesen beiden Viren ist ebenfalls möglich.

Rhino-/Enterovirus:

Wegen der genetischen Ähnlichkeit zwischen dem Humanen Rhinovirus und dem Enterovirus kann das FilmArray RP keine zuverlässige Unterscheidung zwischen diesen beiden treffen. An ein positives Testergebnis des FilmArray RP in Bezug auf Rhinovirus/Enterovirus sollte sich ein alternatives Verfahren (z.B. Zellkultur oder Sequenzanalyse) anschließen.

Bordetella pertussis:

Ergebnisse des FilmArray RP B. pertussis-Assay stimmen wegen unterschiedlicher Sensitivität und Spezifität möglicherweise nicht mit den Ergebnissen von üblicherweise verwendeten Bordetella PCR-Assays überein, die auf die Mehrfachkopie-Insertsequenz (IS481) zielen.
IS481 ist ein Mehrkopien-Target und kommt in mehreren Bordetella-Spezies (B. pertussis, B. holmesii und B. bronchiseptica) vor.
Der FilmArray RP B. pertussis-Assay zielt auf die Einfachkopie/Promotorregion des Pertussis-Toxin-Gens und ist auf eine hohe Spezifität für den Nachweis von B. pertussis ausgelegt.
Obwohl keine Kreuzreaktivität mit nahe verwandten Bordetella -Arten in der klinischen Studie und bei Testen der analytischen Spezifität mit einer Anzahl von Stämmen bei 1 x 106 CFU/ml beobachtet werden konnte, kann es bei hohen Konzentrationen (über 1 x 106 CFU/ml) oder mit seltenen Sequenzvarianten anderer Bordetella-Arten, wie B. bronchiseptica und B. parapertussis zu Fällen von Kreuzreaktivität kommen.

Methode

Multiplex-PCR°

° = nicht akkreditiert

Methodenbeschreibung

Überblick über die Vorgänge und Prozesse, die während eines FilmArray-Laufs stattfinden:

Nukleinsäurereinigung – Die Nukleinsäurereinigung findet in den ersten drei Blistern des Riegels statt. Die Probe wird durch Erschütterung (Bead Beating) lysiert, und die freigesetzte Nukleinsäure wird mittels Magnetkügelchentechnik (Magnetic Bead Technology) gebunden, gereinigt und eluiert. Diese Schritte erfordern etwa zehn Minuten, und die Vorrichtung für die mechanische Lyse kann während der ersten Minute des Betriebs einen hohen langgezogenen Ton erzeugen.
Reverse Transkription und Multiplex PCR 1. Stufe – Da es sich bei einigen Krankheitserregern, die durch den FilmArray ME-Riegel identifiziert werden, um RNA-Viren handelt, wird ein reverser Transkriptionsschritt (RT) durchgeführt, um die virale RNA vor der Amplifizierung in cDNA umzuwandeln. Die gereinigte Nukleinsäurelösung wird mit einer vorerwärmten Master-Mischung kombiniert, um den RT-Schritt zu initiieren und anschließend einem Thermocycling für Multiplex-PCR unterzogen. Das Ziel der 1. PCR-Stufe ist die Anreicherung der Ziel-Nukleinsäuren, die in der Probe vorhanden sind.
PCR 2. Stufe – Die Produkte der PCR der 1. Stufe werden mit frischen PCR-Reagenzien, die einen interkalierenden, fluoreszierenden DNA-Farbstoff (LCGreen® Plus, BioFire Defense, LLC) enthalten, verdünnt und gemischt. Diese Lösung wird über das Array der PCR der 2. Stufe verteilt. Die einzelnen Vertiefungen des Arrays enthalten Primer für verschiedene Assays (jeweils dreifach vorhanden), die auf spezifische Nukleinsäuresequenzen von jedem der nachgewiesenen Krankheitserreger abzielen, ebenso wie auf das Kontroll-Template-Material. Diese Primer sind in die spezifischen Produkte der Multiplexreaktion der 1. Stufe eingebettet (nested PCR), was sowohl die Sensitivität als auch die Spezifität der Reaktionen erhöht.
DNA-Schmelzanalyse – Nach der PCR der 2. Stufe wird die Temperatur langsam erhöht, und die Fluoreszenz in jeder Vertiefung des Arrays wird überwacht und analysiert, um eine Schmelzkurve zu erzeugen. Die Temperatur, bei der ein spezifisches PCR-Produkt schmilzt (Schmelztemperatur oder Tm), ist konsistent und vorhersagbar und die FilmArray Software evaluiert die Daten aus den Replikationsvertiefungen für jeden Assay, um Ergebnisse zu erzielen.

Literatur

BioFire, FilmArray Respiratory Panel (RP), Benutzerhandbuch

Stand: 02.12.2019