Gastrointestinales Panel Biofire
Allgemeines
- Das gastrointestinale Panel ist ein qualitativer In-vitro-Multiplex-Diagnosetest auf Nukleinsäurebasis.
- Es ist in der Lage, aus Stuhlproben, die von Personen mit Anzeichen und/oder Symptomen für Gastrointestinalinfektion erhalten wurden, Nukleinsäuren mehrerer Bakterien, Viren und Parasiten gleichzeitig nachzuweisen und zu identifizieren.
- Die folgenden Organismen werden mittels des gastrointestinalen Panels nachgewiesen:
- Bakterien:
- Campylobacter:
- C. jejuni
- C. coli
- C. upsaliensis
- Clostridioides (früher Clostridium) difficile (C. difficile) Toxin A/B
- Plesiomonas shigelloides
- Salmonella
- Vibrio:
- V. parahaemolyticus
- V. vulnificus
- V. cholerae (spezifischer Nachweis)
- Yersinia enterocolitica
- Enteroaggregative Escherichia coli (EAEC)
- Enteropathogene Escherichia coli (EPEC)
- Enterotoxische Escherichia coli (ETEC) lt/st
- Shiga-Toxin-erzeugende Escherichia coli (STEC) stx1/stx2 (einschließlich des spezifischen Nachweises der E. coli O157-Serogruppe in STEC)
- Shigella/ Enteroinvasive Escherichia coli (EIEC)
- Campylobacter:
- Viren:
- Adenovirus F 40/41
- Astrovirus
- Norovirus GI/GII
- Rotavirus A
- Sapovirus (Genogruppen I, II, IV und V)
- Parasiten:
- Cryptosporidium
- Cyclospora cayetanensis
- Entamoeba histolytica
- Giardia lamblia (auch als G. intestinalis und G. duodenalis bezeichnet)
- Bakterien:
Indikation
- Vd. auf Gastroenteritis
Material
Mindest-Probenvolumen:
- 200 µl Stuhlprobe
Transport und Lagerung:
- Proben sollten so schnell wie möglich verarbeitet und getestet werden.
- Wenn eine Lagerung erforderlich ist, können die Proben bis zu einem Tag bei Raumtemperatur (ungefähr 23 °C) oder bei Kühlschranktemperatur (ungefähr 4 °C) bis zu sieben Tagen aufbewahrt werden
Stabilität | |
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Raumtemperatur | 1 Tag |
2 – 8°C | 4 Tage |
Ansatz- / Messzeiten
täglich
Referenzbereich
Stuhl:
- nicht nachgewiesen
Beurteilung der Ergebnisse
Bakterien:
Campylobacter (C. jejuni/C. coli/C. upsaliensis):
Das FilmArray GI Panel enthält zwei Assays, die dafür ausgelegt sind, gemeinsam die häufigsten Campylobacter-Spezies nachzuweisen, die mit gastrointestinalen Krankheiten des Menschen assoziiert werden: C. jejuni, C. coli undC. upsaliensis, aber sie nicht zu unterscheiden. Dies sind die gleichen drei Spezies, die unter Verwendung von klinischen Standard-Laborpraktiken bestimmt werden. Andere Campylobacter-Spezies werden vom FilmArray GI Panel nicht identifiziert. Empirische Tests und in silico-Sequenzanalyse zeigen eine verringerte Empfindlichkeit für eine weniger häufige Subspezies von C. jejuni (C. jejunisubsp. doylei).
Clostridioides (früher Clostridium) difficile Toxin A/B:
Das FilmArray GI Panel enthält einen einzelnen Multiplex-Assay für die Bestimmung von toxinogenem C. difficile, der sowohl auf das Gen des Toxins A (tcdA) als auch das Gen des Toxins B (tcdB) zielt. Typische toxinogene Stämme erzeugen beide Toxine, aber das Vorhandensein von irgendeinem von beiden zeigt einen pathogenen Stamm an. Empirische Tests und in silico-Sequenzanalysen bestätigen, dass der Assay alle Toxinotypen und den epidemischen hypervirulenten BI/NAP1/027-Stamm nachweist, obwohl diese durch den Assay nicht spezifisch unterschieden werden. Da die Häufigkeit von asymptomatisch verlaufenden Infektionen mit C. difficile unter sehr jungen Kindern und Krankenhauspatienten hoch sein kann, sollte ein Nachweis von toxinogenem C. difficile innerhalb des Kontextes der Richtlinien interpretiert werden, die von der Prüfeinrichtung oder anderen Experten entwickelt worden sind (z. B. Richtlinien/Grundsatzerklärungen, die von der American Academy of Pediatrics18oder der Society for Healthcare Epidemiology of America und der Infectious Disease Society of America herausgegeben worden sind)
Plesiomonas shigelloides:
Das FilmArray GI Panel enthält einen einzelnen Assay für den Nachweis von P. shigelloides, der einzigen bekannten Spezies der Gattung Plesiomonas.
Salmonella:
Das FilmArray GI Panel enthält einen einzelnen Assay, der dafür ausgelegt ist, beide Spezies von Salmonella; S. enterica und S. bongori nachzuweisen. Empirische Tests und in silico-Sequenzanalysen unterstützen den Nachweis aller Subspezies und Serovare von Salmonella. Eine Kreuzreaktivität kann mit bestimmten Stämmen von E. coli vorkommen, die Varianten des kryptischen ETT2 Typ-III Sekretionssystems enthalten.
Vibrio (V. parahaemolyticus/V. vulnificus/V. cholerae) und Vibrio cholerae:
Das FilmArray GI Panel enthält einen einzelnen Assay zum Nachweisen von Vibrio-Spezies, die am häufigsten an Gastroenteritis beteiligt sind (V. parahaemolyticus, V. vulnificus und V. cholerae). Empirische Tests und in silico-Sequenzanalysen zeigen, dass der Assay auch mit einigen weniger häufigen Vibrio-Spezies (d. h. V. alginolyticus, V. fluvialisund V.mimicus) reagieren kann. Der Vibrio-Assay zeigt nicht an, welche Spezies nachgewiesen worden ist, und es wird nicht erwartet, dass der Vibrio-Assay die selteneren V. cincinnatiensis, V. furnissiiund V. metschnikovii nachweist. Ein zweiter Assay für den spezifischen Nachweis von Vibrio cholerae ist ebenfalls enthalten.
Yersinia enterocolitica:
Das FilmArray GI Panel enthält einen einzelnen Assay (Yent), der dafür ausgelegt ist, alle bekannten Serotypen/Biotypen von Y. enterocoliticanachzuweisen. Empirische Tests und in silico-Sequenzanalysen deuten auf ein Potenzial für Kreuzreaktivität mit Y. kristenseniiund Y. frederiksenii hin, wenn die Keimzahlhoch ist (>108KbE/ml). Diese beiden Spezies gehören zur Gruppe der Y. enterocolitica und können durch Kulturmethoden nur schwer von Y. enterocoliticaunterschieden werden; beides sind vermutlich Humanpathogene.
Diarrhöische E. coli:
Das GI Panel enthält mehrere Assays, die dafür ausgelegt sind, genetische Determinanten nachzuweisen, die mit klassischen diarrhöischen E. coli/Shigella-Pathotypen assoziiert werden. Eine horizontale Übertragung dieser Gene zwischen Organismen wurde dokumentiert; daher können Nachweise für mehrere diarrhöische E. coli/Shigella auf das Vorhandensein mehrere Pathotypen oder einen einzigen Stamm zurückzuführen sein, der die charakteristischen Determinanten mehrerer Pathotypen enthält. Ein Beispiel dafür ist der Stamm E. coli O104:H4, der für gehäufte Krankheitsausbrüche im Jahre 2011 verantwortlich war und der Determinanten für sowohl Shiga-Toxin produzierende E. coli (STEC) als auch enteroaggregative E. coli (EAEC) enthält.
Enteroaggregative E. coli(EAEC):
Das FilmArray GI Panel enthält einen Multiplex-Assay (EAEC) für die Bestimmung von zwei Gen-Zielen, die in der Regel mit enteroaggregativem E. coli assoziiert werden; das aggR-Regulatorgen und das mutmaßliche Außenmembranprotein, aatA, die beide auf dem teilkonservierten pAA-Plasmid liegen.
Hinweis: pAA ist nicht in allen Stämmen vorhanden, die phänotypisch als EAEC bestimmtwerden, und nicht alle pAA-Plasmide tragen aggR-und aatA-Gene; daher weist das FilmArray GI Panel nicht alle Mitglieder dieses diversen Pathotyps nach, aber es ist davon auszugehen, dass es die meisten pathogenen Stämme nachweist (unter anderem E. coliO104:H4, der für die Krankheitsausbrüche in Europa verantwortlich war).
Enterotoxigene(ETEC) hitzelabile (lt) und hitzestabile (st) Enterotoxine:
Das FilmArray GI Panel enthält drei Assays (ETEC 1, ETEC 2 und ETEC 3) zum Nachweis von Enterotoxinen, die in enterotoxigenen E. coli(ETEC) vorkommen. Diese Assays sind dafür ausgelegt, das hitzelabile (LT) Enterotoxin (ltA) und zwei hitzestabile (ST) Enterotoxinvarianten (st1a, auch als STp bezeichnet; und st1b, auch als STh bezeichnet) nachzuweisen. Die mitgeteilten Ergebnisse zeigen nicht an, welches von diesem Toxin / diesen Toxinen nachgewiesen worden ist. Ein positives Ergebnis einer Kombination dieser drei Assays liefert als Ergebnis Detected (Nachgewiesen) für enterotoxische E. coli(ETEC) lt/st. Die LT-II Toxinvariante (die dem Aufbau nach LT ähnelt) und die STB/ST2 Toxinvariante (die dem Aufbau nach ST1 ähnelt) stellen kein Target für die ETEC-Assays dar und gelten nicht als wichtig für menschliche Erkrankungen. Empirische Tests und in silico-Sequenzanalysen deuten auf ein Potenzial für eine Kreuzreaktivität mit bestimmten Stämmen von Hafnia alvei,C. koseri,C. sedlakii und Cedecea davisae hin.
Enteropathogene E. coli(EPEC):
Das FilmArray GI Panel enthält einen einzelnen Assay (Ec eae) für den Nachweis von eae, dem Gen, welches das Adhäsin Intimin kodiert. Sowohl typische als auch atypische EPEC werden nachgewiesen, jedoch nicht unterschieden. Die LEE-Pathogenitätsinsel, die das eae-Gen enthält, findet sich in manchen Shiga-Toxin produzierenden E. coli(STEC; O157-und non-O157-Stämme). Daher werden die Ergebnisse des eae-Assays (positiv oder negativ) nur mitgeteilt, wenn STEC nicht nachgewiesen wird. Infolgedessen kann das FilmArray GI Panel nicht zwischen STEC, die eaeenthalten, und einer Co-Infektion von EPEC und STEC unterscheiden.
Shiga-Toxin produzierende E. coli(STEC) Shiga-Toxin-Gene 1 und 2 (stx1/stx2):
Das FilmArray GI Panel enthält zwei Assays (STEC 1 und STEC 2) zum Nachweis von Sequenzen von Shiga-Toxin 1 (stx1) und Shiga-Toxin 2 (stx2). Auf dem Befund wird nicht angezeigt, welches von diesem Toxin / diesen Toxinen nachgewiesen worden ist. Ein positives Ergebnis für einen oder beide von diesen Assays ergibt als Testergebnis für Shiga-Toxin produzierende E. coli(STEC) stx1/stx2Detected (E. coli (STEC) stx1/stx2 nachgewiesen).
Hinweis: Shiga-Toxin (stx; identisch mit stx1von STEC) kommt in Shigella dysenteriaevor; daher kann ein Befunddes FilmArray GI Panel mit positiven Testergebnissen für Shiga-Toxin produzierende E. coli(STEC) stx1/stx2undShigella/enteroinvasive E. coli (EIEC) in derselben Probe auf das Vorhandensein von S. dysenteriae hinweisen.
E. coli O157:
Um die Bestimmung von STEC des O157-Serotyps zu erleichtern, enthält das FilmArray GI Panel einen einzelnen Assay (Ec O157) zum Nachweiseines Gen-Targets, das spezifisch ist für diesen Serotyp. Stämme von E. coli O157, welche die Shiga-Toxin-Gene nicht tragen, wurden ebenfalls identifiziert. Da jedoch die Pathogenität dieser non-STEC-Stämme undefiniert bleibt, wird das Assay-Ergebnis für E. coliO157 nicht mitgeteilt, wenn nicht auch ein Shiga-Toxin-Gen nachgewiesen wird.Ein Nachweis von STEC stx1/stx2 und dem E. coli O157-Target führt dazu, dass E. coli O157 als Kennzeichnung für das positive STEC-Ergebnis genannt wird. Das FilmArray GI Panel kann nicht zwischen Infektionen mit einem einzelnen toxischen STEC O157 oder seltenen Co-Infektionen von STEC (non-O157) mit einem stx1/stx2-negativen E. coli O157 unterscheiden
Shigella/Enteroinvasive E. coli (EIEC):
Das FilmArray GI Panel enthält einen einzelnen Assay zum Nachweisen von ipaH, einem Gen, das spezifisch in Shigella-Spezies sowie in enteroinvasiven E. coli (EIEC) vorkommt. Es ist nicht möglich, Shigella anhand dieses Verfahrens von EIEC zu unterscheiden, und der Nachweis von ipaH führt zu einem positiven Testergebnis Shigella/Enteroinvasive E. coli(EIEC) .
Hinweis: Shiga-Toxin (stx; identisch mit stx1 von STEC), kommt in Shigella dysenteriaevor, daher kann ein Befund des FilmArray GI Panels mit positiven Testergebnissen für Shiga-Toxin produzierende E. coli (STEC) stx1/stx2 mit Shigella/Enteroinvasiven E. coli (EIEC) in derselben Probe auf das Vorhandensein von S. dysenteriae hinweisen.
Viren:
Adenovirus F40/41:
Das Panel enthält einen einzelnen Multiplex-Assay für den spezifischen Nachweis von sowohl Adenovirus F40 als auch F41 (d. h. keine Kreuzreaktion mit non-40/41 Adenovirus-Spezies bei Ausscheidung im Stuhl). Der Befund zeigt nicht an, welcher Serotyp (40 oder 41) nachgewiesen worden ist. Der Assay weist keine anderen Adenovirus-Spezies nach, wie die Spezies B, C und E, die mit respiratorischen Infektionen assoziiert sind.
Astrovirus:
Das Panel enthält einen einzelnen Assay, der dafür ausgelegt ist, acht Subtypen (HAstV1-8) des humanen Astrovirus nachzuweisen. Es ist nicht davon auszugehen, dass der Assay neu identifizierte Astroviren der monophyletischen MLB-und VA-Gruppen nachweist.
Norovirus GI/GII:
Das GI Panel enthält zwei Assays, deren Target jeweils die Norovirus-Genogruppen sind, die am häufigsten mit Infektionen beim Menschen assoziiert sind (GI und GII). Keiner der Assays weist die Genogruppe GIV, nicht-humane Genogruppen oder nahe verwandte Caliciviren, wie das Sapovirus, nach. Der Befund zeigt nicht an, welche Genogruppe(n) (GI und/oder GII) nachgewiesen worden sind.
Rotavirus A:
Das GI Panel enthält zwei separate Assays für Rotavirus A, um sämtliche Stämme von Rotavirus A abzudecken. Eine in silico-Sequenzanalyse zeigt an, dass diese Assays keine Kreuzreaktion aufweisen mit Rotaviren B und C, die weniger häufig an Erkrankungen des Menschen beteiligt sind, oder mit Rotaviren D, E und F , die beim Menschen nicht gefunden worden sind. Empirische Tests haben gezeigt, dass diese Assays rekombinante Viren nachweisen, die in Rotavirus-Vakzinen enthalten sind.
Sapovirus(Genogruppen I, II, IV und V):
Das GI Panel enthält einen einzelnen Assay, der dafür ausgelegt ist, Sapovirus-Genogruppen, die bei menschlichen Infektionen nachgewiesenworden sind (I, II, IV und V) zu detektieren, jedoch ohne zwischen ihnen zu unterscheiden. Die Genogruppe III, ein Schweine-Pathogen, wird nicht nachgewiesen.
Parasiten
Cryptosporidium:
Das Panel enthält zwei Assays zum Nachweis von Cryptosporidium-Spezies. Empirische Tests und in silico-Sequenzanalysen belegen den Nachweis von ungefähr 23 verschiedenen Cryptosporidium-Spezies, einschließlich der häufigsten Spezies mit klinischer Relevanz für den Menschen (d. h. C. hominis und C. parvum), ebenso wie für weniger häufige Spezies (z. B. C. meleagridis, C. felis, C. canis, C. cuniculus, C. muris und C. suis). Die Assays unterscheiden nicht zwischen Spezies, und die sehr seltenen Spezies C. bovis, C. ryanae und C. xiaoi werden möglicherweise nicht nachgewiesen.
Cyclospora cayetanensis:
Das Panel enthält einen einzelnen Assay für den Nachweis von C. cayetanensis, der einzigen Cyclospora-Spezies, die an Erkrankungen des Menschen beteiligt ist.
Entamoeba histolytica:
Das Panel enthält einen einzelnen Assay zum Nachweis von E. histolytica, der einzigen Entamoeba-Spezies, die an Gastroenteritis beteiligt ist. Dieser Assay kann eine Kreuzreaktion mit den nahe verwandten E. dispar zeigen, wenn die Erregerzahl hoch ist (etwa 105 Oozysten/ml oder mehr).
Giardia lamblia:
Das Panel enthält einen einzelnen Assay (Glam), der dafür ausgelegt ist, G. lamblia (aka G. intestinalis, G. duodenalis), die einzige Giardia-Spezies, die für Menschen infektiös ist, nachzuweisen. Eine sehr geringe Häufigkeit einer Kreuzreaktivität mit kommensalen Mikroorganismen (d. h. Bifidobacterium und Ruminococcus) wurde bei der klinischen Bewertung beobachtet.
Grenzen des Verfahrens
- Die Leistungsfähigkeit dieses Tests wurde nicht bei Patienten ohne Anzeichen und Symptome einer Erkrankung des Magen-Darm-Trakts bestimmt.
- Virale, bakterielle und parasitäre Nukleinsäuren können unabhängig von der Lebensfähigkeit des Organismus invivo überdauern. Außerdem verläuft die Infektion mit einigen Organismen möglicherweise asymptomatisch. Ein Nachweis eines oder mehrerer Ziel-Organismen impliziert nicht, dass die entsprechenden Organismen infektiös oder die Ursache klinischer Symptome sind.
- Die Ergebnisse des Tests müssen mit der Anamnese, mit epidemiologischen Daten oder anderen Daten, die dem behandelnden Arztvorliegen, korreliert werden. Aufgrund der großen Häufigkeit von asymptomatischen Trägern von Clostridioides (früher Clostridium) difficile, insbesondere unter sehr jungen Kindern und unter Krankenhauspatienten, sollte der Nachweis von toxischem C. difficileim Kontext von Richtlinien interpretiert werden, die von der Untersuchungseinrichtung oder anderen Experten aufgestellt wurden (z. B. Richtlinien, Normen, die von der American Academy of Pediatrics oder der Society for Healthcare Epidemiology of America und der Infectious Disease Society of America veröffentlicht worden sind).
- Diskrepanzen zwischendem FilmArray GI Panel und anderen mikrobiellen Bestimmungsverfahren können dadurch bewirkt werden, dass es nicht möglich ist, Spezies auf Basis phänotypischer mikrobieller Standard-Bestimmungsverfahren zuverlässig zu unterscheiden. Beispiele sind unter anderem die Unterscheidung zwischen Yersinia enterocolitica und anderen Mitgliedern der Y. enterocolitica Gruppe, wie beispielsweise Y. kristensenii oder Y. fredricksonii, die Unterscheidung zwischen Entamoeba histolytica und E. dispar und die Unterscheidung zwischen Helicobacter pullorumund Campylobacter.
- Es besteht ein Risiko für falsch-negative Werte aufgrund des Vorhandenseins von Sequenzvarianten in den Gen-Targets des Assays, aufgrund von Verfahrensfehlern, Amplifikationsinhibitoren in Proben oder weil die Zahl von Organismen für die Amplifikation nicht ausreicht.
- Der Nachweis von Organismus-Nukleinsäure hängt davon ab, ob die Proben ordnungsgemäß entnommen, transportiert, gelagert und vorbereitet werden. Die Nichteinhaltung der ordnungsgemäßen Vorgehensweise in einem einzigen Schritt kann zu falschen Ergebnissen führen. Es besteht das Risiko, dass nicht ordnungsgemäß entnommene, transportierte oder behandelte Proben zu falsch-positiven oder falsch-negativen Ergebnissen führen. Die RNA-Verfahrenskontrolle und die PCR 2-Kontrolle zeigen nicht an, ob Nukleinsäure aufgrund von nicht ordnungsgemäßerEntnahme, Transport oder Lagern der Proben verloren gegangen ist.
- Es wurde gezeigt, dass mehrere Organismen das Potenzial haben, mit Assays des FilmArray GI Panel Kreuzreaktionen hervorzurufen. Dazu gehören Entamoeba dispar, wenn sie in großen Mengen vorkommen (E. histolytica Assay); Bifidobacterium spp. und Ruminococcus spp. (G. lamblia Assay); bestimmte Stämme von Citrobacter koseri, Citrobacter sedlakii, Hafnia alvei und Cedeceae davisiae, die Varianten eines flagellären Assembly-Proteins enthalten (ETEC 2 Assay), E. coli, die eine Sekretionsprotein Typ III-Variante enthalten (SalmonellaAssay), Grimontia hollisae, die früher zu den Vibrio sp. gezählt wurden (Vibrio Assay), Yersinia frederiksenii und Yersinia kristensenii, die zur Gruppe der Y. enterocolitica gehören (Y. enterocolitica Assay).
Methode
Multiplex-PCR°
° = nicht akkreditiert
Methodenbeschreibung
Überblick über die Vorgänge und Prozesse, die während eines FilmArray-Laufs stattfinden:
- Nukleinsäurereinigung – Die Nukleinsäurereinigung findet in den ersten drei Blistern des Riegels statt. Die Probe wird durch Erschütterung (Bead Beating) lysiert, und die freigesetzte Nukleinsäure wird mittels Magnetkügelchentechnik (Magnetic Bead Technology) gebunden, gereinigt und eluiert. Diese Schritte erfordern etwa zehn Minuten, und die Vorrichtung für die mechanische Lyse kann während der ersten Minute des Betriebs einen hohen langgezogenen Ton erzeugen.
- Reverse Transkription und Multiplex PCR 1. Stufe – Da es sich bei einigen Krankheitserregern, die durch den FilmArray ME-Riegel identifiziert werden, um RNA-Viren handelt, wird ein reverser Transkriptionsschritt (RT) durchgeführt, um die virale RNA vor der Amplifizierung in cDNA umzuwandeln. Die gereinigte Nukleinsäurelösung wird mit einer vorerwärmten Master-Mischung kombiniert, um den RT-Schritt zu initiieren und anschließend einem Thermocycling für Multiplex-PCR unterzogen. Das Ziel der 1. PCR-Stufe ist die Anreicherung der Ziel-Nukleinsäuren, die in der Probe vorhanden sind.
- PCR 2. Stufe – Die Produkte der PCR der 1. Stufe werden mit frischen PCR-Reagenzien, die einen interkalierenden, fluoreszierenden DNA-Farbstoff (LCGreen® Plus, BioFire Defense, LLC) enthalten, verdünnt und gemischt. Diese Lösung wird über das Array der PCR der 2. Stufe verteilt. Die einzelnen Vertiefungen des Arrays enthalten Primer für verschiedene Assays (jeweils dreifach vorhanden), die auf spezifische Nukleinsäuresequenzen von jedem der nachgewiesenen Krankheitserreger abzielen, ebenso wie auf das Kontroll-Template-Material. Diese Primer sind in die spezifischen Produkte der Multiplexreaktion der 1. Stufe eingebettet (nested PCR), was sowohl die Sensitivität als auch die Spezifität der Reaktionen erhöht.
- DNA-Schmelzanalyse – Nach der PCR der 2. Stufe wird die Temperatur langsam erhöht, und die Fluoreszenz in jeder Vertiefung des Arrays wird überwacht und analysiert, um eine Schmelzkurve zu erzeugen. Die Temperatur, bei der ein spezifisches PCR-Produkt schmilzt (Schmelztemperatur oder Tm), ist konsistent und vorhersagbar und die FilmArray Software evaluiert die Daten aus den Replikationsvertiefungen für jeden Assay, um Ergebnisse zu erzielen.
Literatur
- BioFire, FilmArray gastrointestinal (GI) Panel, Benutzerhandbuch
- Stand: 03.12.2019