Blutkultur-Identifikations-Panel Biofire

Blutkultur-Identifikations-Panel

Themenübersicht

Allgemeines

Das Blutkultur-Identifikations-Panel ist ein qualitativer In-vitro-Multiplex-Diagnosetest auf Nukleinsäurebasis mit SEHR kurzer Analysenzeit von 1 Stunde
Es ermöglicht gleichzeitig mehrere Bakterien- und Hefe-Nukleinsäuren nachzuweisen und zu bestimmen und genetische Determinanten für eine Resistenz gegen Antimikrobiotika auszuwählen
Die folgenden 24 Organismen werden bei Anwendung des FilmArray ME Panel bestimmt:
- Bakterien:
  - grampositiv:
    - Enterococci
    - Listeria monocytogenes
    - Staphylococci (einschließlich einer spezifischen Unterscheidung von Staphylococcus aureus)
    - Streptococci (mit spezifischer Unterscheidung von Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae und Streptococcus pyogenes)
  - gramnegativ:
    - Acinetobacter baumannii
    - Enterobacterales (ehemals Enterobacteriaceae; einschließlich einer spezifischen Unterscheidung des Enterobacter cloacae-Komplexes)
      - Escherichia coli
      - Klebsiella oxitoca
      - Klebsiella pneumoniae
      - Proteus
      - Serratia marcescens
    - Haemophilus influenzae
    - Neisseria meningitidis (verkapselt)
    - Pseudomonas aeruginosa
  - Hefen:
  - Candida albicans
  - Candida glabrata
  - Candida krusei
  - Candida parapsilosis
  - Candida tropicalis
- Genetische Determinanten für einen Antibiotika-Resistenz:
  - mecA (gegen Methicillin)
  - vanA und vanB (gegen Vancomycin)
  - bla_KPC (gegen Carbapeneme)

Indikation

Verdacht auf Sepsis:
- Fieber
- Bewusstseinsstörungen

Material

Probenentnahme:

Der Test kann an aeroben oder anaeroben Blutkulturflaschen durchgeführt werden, die von einem kontinuierlich überwachenden Blutkulturinstrument als positiv gekennzeichnet wurden.

Mindest-Probenvolumen:

200 µl Probe sind zum Testen erforderlich

Transport und Lagerung:

Blutkulturproben sollten so bald wie möglich verarbeitet und getestet werden, nachdem sie von dem Kultur-Gerät als positiv gekennzeichnet wurden.
Jedoch können die Proben vor dem Testen für bis zu 8 Stunden bei Raumtemperatur oder in dem Kultur-Gerät aufbewahrt werden.

Stabilität
Raumtemperatur	8 Stunden

Ansatz- / Messzeiten

täglich

Referenzbereich

Abstrich:

Nicht nachgewiesen

Beurteilung der Ergebnisse

Wenn die PCR der 2. Stufe abgeschlossen ist, führt das FilmArray-Gerät/-Module eine hochauflösende DNA-Schmelzanalyse der PCR-Produkte durch und misst das Fluoreszenzsignal, das in den einzelnen Vertiefungen erzeugt wird. Die FilmArray Software führt dann mehrere Analysen durch und gibt am Ende ein Assay-Ergebnis aus.

Analyse von Schmelzkurven:

Die FilmArray Software evaluiert die DNS-Schmelzkurve für jede Vertiefung des PCR-Array der 2. Stufe, um zu bestimmen, ob ein PCR-Produkt in der Vertiefung vorhanden war.
Wenn das Schmelzprofil das Vorhandensein eines PCR-Produkts anzeigt, berechnet die Analyse-Software die Schmelztemperatur (Tm) der Kurve.
Der Tm-Wert wird dann mit dem erwarteten Tm-Bereich für den Assay verglichen. Wenn die Software bestimmt, dass der Schmelzpunkt positiv ist, und der Schmelz-Peak in den Assay-spezifischen Tm-Bereich fällt, wird die Kurve als positiv bezeichnet.
Wenn die Software bestimmt, dass die Schmelze negativ ist oder nicht im richtigen Tm-Bereich liegt, wird die Kurve als negativ bezeichnet.

Analyse von Replikaten:

Sobald Schmelzkurven bestimmt worden sind, evaluiert die Software die drei Replikate für jeden Assay, um das Assay-Ergebnis zu bestimmen.
Damit ein Assay als positiv gelten kann, müssen mindestens zwei von den drei zusammengehörigen Schmelzkurven positiv sein und die Tm der drei positiven Kurven müssen ähnlich sein (innerhalb von 1°C).
Assays, die dieses Kriterium nicht erfüllen, gelten als negativ.

Interpretation von Organismen:

Die Interpretationen für viele von den Organismen basieren auf den Ergebnissen eines einzigen Assays.
Interpretationen für Haemophilus influenzae und die Staphylococcus-, Streptococcus- und Enterobacteriaceae-Gruppen beruhen auf den Ergebnissen mehrerer Assays.
Die Antimikrobiotikumresistenzgene basieren auch auf dem Ergebnis eines einzigen Assays; jedoch werden die Testergebnisse nur mitgeteilt, wenn außerdem spezifische Organismen in der gleichen Probe nachgewiesen werden.

HINWEIS:

Polymikrobielle Blutkulturen mit 3 oder mehr unterschiedlichen Organismen sind möglich, jedoch selten.
Wenn Detected-Ergebnisse (Nachgewiesen) für 3 oder mehr unterschiedliche Organismen in einer Probe gemeldet werden, wird ein erneuter Test empfohlen, um das polymikrobielle Ergebnis zu bestätigen.

Grenzen des Verfahrens

FilmArray BCID ist als Hilfe bei der Diagnose spezifischer Verursacher von Bakteriämie und Fungämie indiziert, und die Ergebnisse sollten in Verbindung mit anderen klinischen und Laborbefunden verwendet werden.
Positive FilmArrayErgebnisse schließen keine Koinfektion mit Organismen aus, die nicht im Blutkultur-Identifikations-Panel enthalten sind.
FilmArray BCID ist nicht dazu gedacht, eine Bakteriämie- oder Fungämie-Behandlung zu überwachen.
Eine Subkultivierung von positiven Blutkulturen ist nötig, um Organismen für Anfälligkeitsuntersuchungen und epidemiologische Typisierung zu gewinnen, um Organismen in der Blutkultur zu bestimmen, die vom FilmArray BCID Panel nicht nachgewiesen werden, und für die Bestimmung einiger Staphylococcus-, Enterococcus-, Streptococcus- und Enterobacteriaceae-Spezies, die von den Blutkultur-Identifikations-Panel-Assays nicht spezifisch identifiziert werden.
Das FilmArray BCID Panel kann gemischte Kulturen möglicherweise nicht unterscheiden, wenn zwei oder mehr Spezies derselben Gattung oder Organismengruppe in einer Probe vorhanden sind (z.B. S. aureus und S. epidermidis).
Dieses Produkt sollte nicht verwendet werden, um Blutkulturmedien zu testen, die Aktivkohle enthalten. Aktivkohle-haltige Medien können nicht-lebensfähige Organismen und/oder Nukleinsäure in Anteilen enthalten, die vom Panel nachgewiesen werden können.
Das FilmArray BCID Panel enthält keine Assays für obligat anaerobe Mechanismen, die in Blutkultur nachgewiesen werden könnten.

Genetische Determinanten für eine Antibiotika-Resistenz:

Das nachgewiesene Antimikrobiotikumresistenzgen kann, muss jedoch nicht mit dem Wirkstoff assoziiert sein, der für die Erkrankung verantwortlich ist.
Negative Ergebnisse für diese speziellen Antimikrobiotikumresistenzgen-Assays zeigen keine Anfälligkeit an, da mehrere Mechanismen existieren, die eine Resistenz gegen Methicillin, Vancomycin und Carbapeneme bewirken.

Methode

Multiplex-PCR°

° = nicht akkreditiert

Methodenbeschreibung

Überblick über die Vorgänge und Prozesse, die während eines FilmArray-Laufs stattfinden:

Nukleinsäurereinigung – Die Nukleinsäurereinigung findet in den ersten drei Blistern des Riegels statt. Die Probe wird durch Erschütterung (Bead Beating) lysiert, und die freigesetzte Nukleinsäure wird mittels Magnetkügelchentechnik (Magnetic Bead Technology) gebunden, gereinigt und eluiert. Diese Schritte erfordern etwa zehn Minuten, und die Vorrichtung für die mechanische Lyse kann während der ersten Minute des Betriebs einen hohen langgezogenen Ton erzeugen.
Reverse Transkription und Multiplex PCR 1. Stufe – Da es sich bei einigen Krankheitserregern, die durch den FilmArray ME-Riegel identifiziert werden, um RNA-Viren handelt, wird ein reverser Transkriptionsschritt (RT) durchgeführt, um die virale RNA vor der Amplifizierung in cDNA umzuwandeln. Die gereinigte Nukleinsäurelösung wird mit einer vorerwärmten Master-Mischung kombiniert, um den RT-Schritt zu initiieren und anschließend einem Thermocycling für Multiplex-PCR unterzogen. Das Ziel der 1. PCR-Stufe ist die Anreicherung der Ziel-Nukleinsäuren, die in der Probe vorhanden sind.
PCR 2. Stufe – Die Produkte der PCR der 1. Stufe werden mit frischen PCR-Reagenzien, die einen interkalierenden, fluoreszierenden DNA-Farbstoff (LCGreen® Plus, BioFire Defense, LLC) enthalten, verdünnt und gemischt. Diese Lösung wird über das Array der PCR der 2. Stufe verteilt. Die einzelnen Vertiefungen des Arrays enthalten Primer für verschiedene Assays (jeweils dreifach vorhanden), die auf spezifische Nukleinsäuresequenzen von jedem der nachgewiesenen Krankheitserreger abzielen, ebenso wie auf das Kontroll-Template-Material. Diese Primer sind in die spezifischen Produkte der Multiplexreaktion der 1. Stufe eingebettet (nested PCR), was sowohl die Sensitivität als auch die Spezifität der Reaktionen erhöht.
DNA-Schmelzanalyse – Nach der PCR der 2. Stufe wird die Temperatur langsam erhöht, und die Fluoreszenz in jeder Vertiefung des Arrays wird überwacht und analysiert, um eine Schmelzkurve zu erzeugen. Die Temperatur, bei der ein spezifisches PCR-Produkt schmilzt (Schmelztemperatur oder Tm), ist konsistent und vorhersagbar und die FilmArray Software evaluiert die Daten aus den Replikationsvertiefungen für jeden Assay, um Ergebnisse zu erzielen.

Literatur

BioFire, FilmArray Blood Culture Identification (BCID) Panel, Benutzerhandbuch

Stand: 18.12.2019